تخليق الجينات هو العملية البيولوجية لبناء وتجميع جينات جديدة من النيوكليوتيدات من الصفر. يختلف تخليق الجينات الاصطناعي عن تخليق الحمض النووي الذي يحدث داخل الخلايا الحية. ويكمن الاختلاف الجوهري في أنه لا يتطلب وجود حمض نووي أصلي. فهو يسمح بإنشاء جزيئات اصطناعية من الحمض النووي لا تتقيد بحجم أو تسلسل نيوكليوتيداتها. كما يمكن نسخ وتخليق أي تسلسل، سواء كان موجودًا بشكل طبيعي أم لا. وقد أدى البحث والتقدم في مجال تخليق الجينات إلى قفزات نوعية في علم الأحياء، حيث أصبح بإمكان العلماء الآن إعادة برمجة الجينومات والخلايا بأكملها بسهولة.
تشمل الفوائد العلمية للتوليف الجيني ما يلي:
- استخدم الباحثون التوليف الجيني لتحديد الظروف التي تتكاثر فيها الخلايا السرطانية السرطانية. وقد شكل هذا أساسًا لإنشاء علاجات يمكنها علاج السرطان بشكل فعال.
- عندما يقوم العلماء بإجراء التسلسل الفيروسي باستخدام تخليق الجينات الاصطناعي، فإنه ينتج لقاحات أكثر أمانًا وفعالية تعتمد على الحمض النووي.
- يتيح متغير شانيل رودوبسين إمكانية تنشيط الخلايا العصبية العميقة في الدماغ من خلال التنشيط البصري غير الجراحي.
- يمكن لعلماء الأحياء النباتية استخدام التوليف الجيني لدراسة إعادة البرمجة التنموية في الأنسجة الوعائية للنباتات. عند إجراء مثل هذه الدراسات، يمكن استخدام التجميد للمساعدة في الحفاظ على عينات الجينات. بوضع هذا بعين الاعتبار، تحقق من مجففات التجميد هذه مثالية لحفظ المواد الحساسة لدرجة الحرارة.
الخطوات المتبعة في تخليق الجينات
يتبع العلماء عملية من خمس خطوات عندما يقومون بعملية التوليف الجيني. الخطوات الخمس هي:
- تصميم Oligo وتحسين التسلسل
- توليف أوليجو
- التجمع الجيني
- التحقق والتصحيح
- تحضير الحمض النووي الاصطناعي
1. تصميم Oligo وتحسين التسلسل
الخطوة الأولى في العملية هي اختيار الجين الذي يثير اهتمامك. بعد عزل الجين، سيتعين عليك إنشاء التسلسل الذي تريد تركيبه. على سبيل المثال، إذا كنت تهدف إلى تعظيم مستويات التعبير البروتيني غير المتجانس، فإن المسار المثالي الذي يجب اتباعه هو تحسين الكودونات. ومن ناحية أخرى، قد لا تكون هذه العملية مفيدة إذا كنت تهدف إلى دراسة التنظيم الداخلي للتعبير الجيني. فيما يلي الأدوات الأكثر شيوعًا المستخدمة في عملية تصميم Oligo وإيجابياتها وسلبياتها:
- يعمل الحمض النووي: فهو سهل الاستخدام ويمكنه التنبؤ بنتائج التهجين غير المتجانس من نوع Oligo. ومع ذلك، فإن النتائج المستندة إلى المحاكاة قد لا تقدم تمثيلاً دقيقًا للنجاح الفعلي في التجميع.
- Gene2Oligo: الواجهة سهلة الاستخدام وتحتوي على تجميعات قائمة على LCR وPCR. ومن ناحية أخرى، لن يكون مفيدًا إذا كان الجين الخاص بك أطول من كيلو بايت واحد.
- TMPrime: TMPrime: يقدم تجميعات قائمة على LCR وPCR ومجموعة واسعة من درجات حرارة الذوبان والتليين. العيب الوحيد هو أن المستخدمين عديمي الخبرة قد يجدون الواجهة معقدة. يحتاج المستخدمون إلى فهم معلمات الإدخال المختلفة لعمليات الإرسال الدقيقة.
عند الانتهاء من التسلسل للتوليف، فإن الخطوة التالية هي تقسيم الجين إلى أجزاء أصغر لتصنيعها وتجميعها. العوامل التي تؤثر على هذه الخطوة تشمل طول Oligo، والميل إلى تشكيل دبوس الشعر، وتكرار التسلسل.
2. توليف اليغو
الخطوة الأولى في تخليق الحمض النووي هي تكوين أليغنوكليوتيدات قصيرة. يحقق العلماء ذلك باستخدام كيمياء الفسفوراميديت لإضافة مونومرات النيوكليوتيدات معًا. تعتبر كيمياء الفوسفوراميديت مفيدة لأنها تمنع الشريط المتنامي من الانخراط في تفاعلات غير مرغوب فيها أثناء عملية التكوين. فهي تجمع مجموعة الفسفوراميديت مع 3'O لمنع التفرع غير المرغوب فيه أثناء التكوين. تحتوي مجموعة الفوسفورميديت على ثنائي إيزوبروبيلامين، الذي يوفر الحماية والفوسفيت الميثيلي. دورة تفاعل الفوسفورميديت المكونة من أربع خطوات هي كما يلي:
- إزالة الحماية: هنا، يتم إزالة مادة DMT عن طريق الغسيل باستخدام حمض خفيف مثل حمض ثلاثي كلورو أسيتيك. هذا يعرض 5'O لردود الفعل.
- الاقتران: يرتبط 3'O من النوكليوتيدات الثانية مع 5'O من النوكليوتيدات الأولى.
- السد: هنا، جميع الـ 5'OHs لأي نيوكليوتيد لم ينضم إلى مادة مساعدة تساعد بطريقة لا تنخرط في تفاعلات غير مرغوب فيها في وقت لاحق من العملية.
- الأكسدة: هنا يتم إضافة اليود، لتكوين رابطة فوسفوديستر من رابطة ترايستر الفوسفات، مما يؤدي إلى تكوين العمود الفقري للحمض النووي.
يقوم الخبراء بتنفيذ هذه الخطوة باستخدام عمود معملي أو مركب متخصص.
3. الجمعية الجينية
تهدف هذه الخطوة إلى تجميع Oligos المجزأة إما في جينات كاملة أو لبنات بناء الجينوم. أربعة أنواع من التجميع مفيدة في تجميع الجينات. تعتمد فعالية طريقة تجميع الجينات على طول التسلسل الذي يريدون دمجه. طرق التجميع الأكثر شيوعًا هي:
- تفاعل سلسلة Ligase أو LCR: يستخدمون DNA Ligase لربط الأطراف المتداخلة لـ Oligos الاصطناعية.
- تجميع سلسلة البوليميراز: يجمعون كل Oligos الذين تقطعت بهم السبل في أنبوب واحد، ثم يقومون بالتدوير الحراري لتسهيل الانضمام.
- إعادة التركيب المتماثل داخل الجسم الحي في الخميرة: مثالي لخيوط النيوكليوتيدات الطويلة التي تصل إلى 200 نيوكليوتيدات و1000 نقطة أساس.
- الاستنساخ المستقل بالتسلسل والربط: يستخدمون ناقل البلازميد لتجميع ما يصل إلى خمس أجزاء من الجينات. يفعلون ذلك عن طريق دمجه في ناقل البلازميد.
4. التحقق والتصحيح
تتضمن الخطوة الرابعة التحقق من التسلسل الذي تم إنشاؤه وتصحيح أي أخطاء قد تحدث أثناء العملية. ويتضمن أيضًا اختبار جميع التسلسلات قبل إطلاقها للاستخدام. تتم إزالة أي تسلسلات تحتوي على طفرات من المجموعة المجمعة. تشمل العمليات الأخرى التي تشكل جزءًا من مراقبة الجودة ما يلي:
- الإدراج
- الحذف
- الإنهاء المبكر
في بعض الأحيان، لا يستطيع الخبراء الحصول على التسلسل الصحيح من مجموعة الحمض النووي المركب لتضخيمه. هنا، يستخدمون طرقًا مختلفة لاكتشاف الأخطاء وتصحيحها. قد يقرر العلماء استخدام التهجين الصارم لـ Oligos المصمم بعناية. يمكنهم أيضًا اختيار الرحلان الكهربائي كطريقة تنقية شاملة. خيار آخر قابل للتطبيق هو قياس الطيف الكتلي. تعتمد الطريقة البيوكيميائية التي يستخدمونها على مدى نجاحهم في تنقية الحمض النووي.
تتضمن الطرق الأخرى التي يستخدمونها الربط غير المتطابق، والذي يُعرف أيضًا باسم الانقسام غير المتطابق. هنا، يستخدمون نوكليازات بدائية النواة، وهي عملية يتم فيها استخدام المقايسات الوظيفية لتصحيح التسلسلات الصحيحة.
قبل البدء في هذه العملية، من المستحسن أن نفهم أن حوالي ثلث إجمالي المنتج المُصنَّع فقط سيكون بالجودة المطلوبة. لتبسيط العملية، يقومون فقط باستنساخ الخيوط التي وجد أنها لا تحتوي على أخطاء. العمل مع مختبر أو برنامج يفهم
5. تحضير الحمض النووي الاصطناعي
هذه هي الخطوة الأخيرة في العملية. هنا يصبح الحمض النووي الاصطناعي جاهزًا للتطبيقات النهائية. تشكل عدة عمليات جزءًا من هذا الإعداد لتطبيقات المستخدم النهائي:
- الاستنساخ: يقومون باستنساخ الجينات الاصطناعية إلى نواقل مفيدة تشمل النواقل البلازميدية أو الفيروسية. في بعض الأحيان، يقوم الخبراء بتصميم جينات اصطناعية تقيد مواقع الإنزيمات، والأذرع المؤتلفة، والتسلسلات المجاورة الأخرى.
- التكاثر: يصعب نشر الجينات الاصطناعية لعدة أسباب. أولاً، يجد الخبراء صعوبة في تضخيم بنيات البلازميد ذات عدد النسخ المنخفض باستخدام مضيفات بكتيرية. كما أن بعض الجينات تغير فيزيولوجية مضيفيها، وأخيرًا، تستنزف الجينات الطويلة الخلية المضيفة بسبب عبء الطاقة الذي تمارسه عليها. في بعض الأحيان، يتعين على الخبراء التعامل مع الجينات السامة في مضيفين معينين وغير ضارة في مضيفين آخرين. سيحاول العلماء تحديد المضيف البكتيري المثالي لنجاح عملية الانتشار.
- السلامة الحيوية: أخيرًا، ستتلقى الهيئات ذات الصلة تقارير عن العملية المستخدمة، وتقييم الأدلة، وتحديد ما إذا كان المنتج الناتج آمنًا لعامة السكان. على سبيل المثال، تقوم اللجنة الاستشارية للحمض النووي المؤتلف بمراجعة البروتوكولات للتأكد من الحفاظ على السلامة وأن المنتج لن يشكل أي خطر على البيئة.
خاتمة
يعد التوليف الجيني مفيدًا جدًا عند القيام به بشكل صحيح. ستوجهك هذه الخطوات الخمس خلال العملية. إذا كنت تفكر في إنشاء جين اصطناعي لأي غرض، فتأكد من الاتصال بالخبراء للتأكد من اتباع الخطوة الصحيحة بالترتيب الأكثر دقة.